본 내용은 2010년 발행된 Current topics of microbiology에 게재된 “Mucosal immune responses induced by transcutaneous vaccines”를 번역한 것입니다.

[요약] 피부가 백신의 처치 부위로 연구된 것은 1990년대 후반에 이르러서였다. 그러면서 피부에 존재하는 여러 세포들과 면역 반응에서 그것들의 역할, 피부를 통해 유입된 항원의 운명에 대해서 많은 것들이 발견되었다. 피부를 통한 면역(Transcutaneous immunization, 이하 TCI)은 다양한 병인체에 대해 면역 반응을 유도하는 안전하고 효과적인 방법이다. TCI의 가장 주목할만한 효과 중 하나는 전신 면역과 점막 면역 모두를 유도할 수 있다는 것이다. 이번 장(章)에서는 손상되지 않은 피부 안으로의 항원 이동, TCI에서 중요한 역할을 하는 피부의 파수꾼(면역) 세포들, 발생된 점막 면역의 유형에 초점을 두었다. 쥐를 대상으로 한 실험을 통하여 TCI에 의해 유도되는 다양한 반응에 대한 정보를 얻을 수 있었다. 세포성 및 체액성 반응들과 시험적 감염에 대한 방어는 위장관, 생식기관 및 호흡기에서 강조되었다. 임상 실험은 인간에서 이러한 백신 투여 방법의 장점을 보여 주었다. 다른 경로를 통한 면역과 함께, 백신 제조와 보조제(adjuvant)의 선택이 적절한 반응을 얻기 위해 중요할 수 있으며 점막의 병원체들에 대한 TCI의 효능을 높이기 위해 피부에서 특정 면역 세포를 활성화시키는 데 초점을 둘 수 있다.

1.  서론(Introduction)
TCI(피부를 통한 면역)는 피부에 백신 항원을 직접 투여하여 항원 특이적인 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도하는 새롭고, 안전하며 비침습적(non-invasive)인 방법이다. 무침(needle free) 면역의 장점들은 더 쉽고 빠르게 예방접종 실시, 안전성의 향상, 주사 부위의 통증을 감소, 잘 훈련된 인력의 절감, 그리고 예방 접종 계획의 준수율 향상들을 포함한다. 다른 상피들과 같이, 피부는 체내와 체외 환경 사이의 물질 교환을 조절하는 중요한 기능을 수행한다. 수분 손실, 화학적 또는 물리적 상처, 및 병원균의 침입 등에 대한 장벽(barrier)으로서 피부의 역할은 광범위하게 연구되었다. 그러나 최근의 수 십 년 동안에서야 피부의 면역 반응 세포들의 왕성한 역할에 주목하게 되었다. 보다 최근에는 피부를 백신 접종 부위로 사용하는 개념이 탐구되었다. 피부 예방접종(topical vaccination)에 대한 첫 연구는 1997년으로 기록되었다. 이후 발표된 연구들의 상당한 수는 동물과 사람에서 TCI가 효과적인 백신 전달 방법이 될 수 있는 가능성을 입증하였다. 또한 TCI의 결과는 사용하는 보강제의 선택이 핵심적인 역할을 한다는 것이 분명해졌다. 1998년 최초로 발표되었듯이, 전신성 및 점막성 부분 모두에서 체액성 및 세포성 반응의 유도는 전통적인 비경구적 백신 처치에 대한 TCI백신의 가장 주목할 만한 이점 중 하나이다.

2.  피부를 통한 항원의 전달 (Transport of Antigen Through the Skin)

Fig. 1 돼지 피부 표본의 주요 조직 층, 표피층 (A), 진피층 (B), 두 층 사이에 위치하는 기저막(basement membrane (C))를 보여주는 H&E stain. 표피층의 가장 바깥 쪽 부분인 각질층(D).
피부는 표피층(epidermis), 진피층(dermis), 하피층(hypodermis) 혹은 피하조직(subcutis) 등 세 개의 주요 층으로 구성되어 있다. Figure 1.은 피부의 가장 바깥 층 구조의 현미경 사진이다. 피부를 통한 면역반응과 관련된 세포들은 표피층과 진피층 내에 위치하고 있다. 효과적인 면역 반응을 일으키려면 피부로 적용된 항원들은 면역 반응 세포와 만나기 위해 피부 가장 바깥의 각질층을 통과해야만 한다. 피부의 가장 바깥 부분인 각질층(stratum corneum)은 빽빽하게 가득 찬 지질 분자들로 둘러싸인 핵이 없고 각질화된 세포들로 구성되어 있다. 이 층은 수분 손실과 병원균의 침입을 차단하는 장벽 역할을 하며 또한 큰 분자량의 항원의 투과성을 제한한다. 이러한 TCI의 제한점을 극복하기 위한 다양한 기술들, 즉 보강제(adjuvants)의 사용, 테이프 붙였다 벗겨내기(tape stripping), 알코올 등 다른 용액들을 이용한 문지르기(swabbing), 수화(hydration, 물에 불리기?), 초음파, 현미침(microneedles), 다른 물리화학적 투과 개선제 등을 이용하여 견고한 각질층의 파괴를 포함한 여러가지 방법들이 고려되어 왔다.  테이프를 이용한 피부 벗겨내기(tape stripping)와 용액의 도포는 피부 장벽을 해제할 뿐 아니라 사이토카인과 공동 자극 분자들의 표출(expression)을 증가시키고 항원 제시를 증가시키기 위하여 정주성(resident) 세포들을 활성화 시킨다. 이러한 방법들이 항원들의 투과를 증가시키고, 면역 반응을 향상시키는 반면에, 높은 면역성을 가진 항원과 보강제가 온전한 피부를 통해서 이동하여 방어 면역이 유도되는 것 또한 입증되었다.
TCI에서 또다른 고려 사항은 항원이 처치되는 해부학적 부위이다. 투여된 항원의 투과성에 잠재적 차이가 생길 수 있음을 시사하는, 피부의 구성과 두께는 신체의 부위에 따라 차이가 있는 것으로 알려졌다.  몇몇 연구들은 쥐에서 해부학적 부위의 차이에 따른 TCI의 효과를 비교했다. 비록 귀와 옆구리에서 TCI 이후 피부 상주 수지상 세포(Dendritic cells)들의 역할에는 차이가 있었으나, 유출 림프절(draining lymph node))에서 T cell의 증식에는 차이가 관찰되지 않았다. 또한 귀나 등을 통한 TCI에 따른 혈청 항체 수준에는 의미 있는 차이가 없었다. 그러나 등과 배에 HIV peptide와 콜레라 독소 보강제를 주입했을 때는 귀에 주입했을 때와 비교하여 보다 높은 혈청 항체 반응을 보였다. 장관 점막에서 항원 특이 CD8+ 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T lymphocytes, CTLs) 역시 귀에 예방주사를 했을 때 배나 등에 시행했을 때 보다 더 낮았다. 임상실험에서, 피부를 통한 백신은 참가자들의 상박(upper arm)과 팔뚝(forearm)에 시행되었다.

3.  피부의 면역 반응 세포(immune-responsive cells in the skin)

피부는 단지 물리 화학적 손상으로부터 개체를 보호하는 수동적인 방어벽 역할만 하지 않는다. 우리는 이제 비염증성(non-inflamed) 피부가 많은 면역 반응 세포를 가지고 있는 면역학적으로 활동적인 부위임을 알고 있다. 피부에 있는 이러한 많은 면역 반응 세포들의 존재와 기능은 피부의 각질층(stratum corneum)을 투과하는 항원에 대한 반응을 결정한다.

그림 2는 여러 층으로 이루어진 표피(epidermis), 진피(dermis), 그리고 면역적 감시, 항원 흡수, 면역 반응의 시작에 관여하는 주된 세포 종류들을 도식적으로 보여주고 있다. 피부의 면역반응에 관여하는 것에는 각질형성세포(keratinocyte), 표피와 진피의 수지상세포(Dendritic cell), T 림프구, 자연살상세포(natural killer T cell), 비만세포(mast cell), 대식세포(macrophage), 등이 있다. 흥미롭게도 몇몇 점막조직에서 보이는 B 세포와 B 세포 소절(B cell follicle), 배자중심(germinal center)은 피부에서는 아직 발견되지 않았다.

   3.1  각질 형성 세포(keratinocyte)
표피세포의 95%를 구성하는 각질형성세포는 표피의 주 세포로서, 피부 방어벽의 구조적 유지에 기여하는 선형 단백질인 케라틴(keratin)을 생산하는 역할을 한다. 다양한 사이토카인(cytokine)과 케모카인(chemokine)의 생성을 통해 각질형성세포는 선천적, 후천적 국소면역에 기여할 뿐만 아니라, 피부가 물리적인 방어벽을 유지하는 데에도 핵심적인 역할을 한다. 각질형성세포에 의한 사이토카인과 케모카인의 생성은 다양한 자극에 대해 본질적으로 및 다양한 자극에 대한 반응으로 일어난다.  표피 장벽의 파괴는 각질형성세포에 의한 사이토카인 생성을 유도할 수 있다. 다른 세포 들에 의해 생성된 염증전(proinflammatory) 사이토카인에 의해서도 활성화가 촉발된다. 면역반응 초기에 각질형성세포가 생성한 사이토카인은 피부에 있는 항원 제시 세포들(APCs;antigen presenting cells)의 이동을 유도한다. 선천성 면역(innate immunity)의 관점에서 보면, 각질형성세포는 Toll-like receptor(이하 TLR)을 발현하여 바이러스와 세균에 대한 면역반응을 일으키는 데 관여한다. 각질형성세포의 TLR 활성화는 DC의 활성화를 강화한다는 것이 생체 외(in vitro)에서 보여 주었다. 최근 발표자료에 따르면 각질형성세포는 비전문화된 APC의 역할도 할 것으로 생각되는데, 왜냐하면 이 세포는 MCH class Ⅱ를 발현하여 CD4+, CD8+ T 세포에 펩티드(peptide) 항원을 제시할 수 있기 때문이다. 각질형성세포는 피부의 면역 반응을 세포성, 체액성 면역 반응으로 유도하는 역할, 표피의 두께를 조절하는 역할, 혈액으로부터 유입된 백혈구의 성장, 성숙, 그리고 이동을 촉진하는 역할을 수행한다.
   3.2  수지상 세포(Dendritic cells, 이하 DCs)
피부에는 대식세포나 DC와 같은 APC가 다수 존재한다. 이러한 APC는 피부의 순찰중인 초병으로서, 병원체에 대항하는 선천성 면역의 필수 구성요소이다. 대식세포가 주로 병원체 제거 기능을 한다면, DC는 선천면역과 적응면역을 연결시키는 데 특화되어 있으며 주된 역할은 항원 제거보다는 항원 제시이다. DC는 전문화된 APC이며 항원을 포획하고 가공하여 공동자극분자(co-stimulatory molecule) 주위의 MHC 분자 표면에 제시한다. DC는 특히 기폭성 원시적(naïve) T 세포가 항원특이적 면역 반응을 시작할 수 있도록 자극하는 역할을 한다.
두 종류의 DCs-진피 수지상 세포(dermal DC (dDCs))와 랑게르한스 세포(LCs)-는 인간과 동물의 피부에 풍부하다. 자극을 받으면 dDCs와 LCs는 항원을 흡수하며, 분화하여 성숙되고, 수입림프관(afferent lymphatic vessel)을 통해 유출 림프절(draining lymph node)로 이동한다. 이곳에서 미성숙 T 세포, B 세포와 접촉한다. 표피에서 LCs는 항원 제시에 중요한 역할을 한다. LCs는 전체 표피 세포의 대략 2% 정도를 차지한다. 하지만 그림3에 설명된 것처럼, 2%의 LCs가 피부 전체 표면의 25%를 덮고 있다. LCs의 배열방향은 피부와 평행하며, 가지돌기(dendrite)들은 피부를 침입한 외부 항원에 대한 노출을 극대화한다. 일부 LCs는 기저막 쪽의 깊은 층에 존재하는 경우도 있지만, 전형적으로 LCs는 생존성(viable) 표피의 상층부에 위치하고 있다. 대부분의 초기 LC에 대한 연구는 LC세포의 접촉성 과민증(contact hypersensitivity)에서의 역할 연구에 집중 되었었다. 전신 면역 반응에서 LC의 역할은 보다 더 명확히 밝혀지고 있다.
LCs의 독특한 특징은 세포질에 존재하는 Birbeck 과립(Birbeck granule)이다. 이러한 테니스 라켓 모양을 한 세포 기관의 발달은 식균작용(endocytic) 수용체인 langerin/CD207의 발현에 의존적이다. LC의 또다른 특징으로 생각되었던 langerin 발현은 최근에 LC뿐 아니라 진피의 다른 DC에서도 보여 주었다. 골수에서 유래된 순환(circulating) DC 또한 langerin을 발현한다. LC에 의해 발현되는 또다른 특징적인 분자는 CD1a이다. 이 분자는 펩티드 항원뿐만 아니라 특정 세균의 지질과 당지질을 T 세포에 제시하는 LC의 기능과 연관되어 있다. LCs는 피부에서 유출 림프절로 이동하는 동안 공동 자극 분자인 CD40인 MHC Class Ⅱ 분자와 림프절 귀소(homing) 분자인 CCR7의 수용체 수를 증가시킨다.
LCs와 같이, dDCs 또한 능동적인 면역 반응 세포이다. 진피성 수지상 세포(dDCs)는 표피에 존재하는 것들 보다 훨씬 최근에 동정되었으며 LCs 만큼 특징이 명확히 밝혀지지 않았다. dDCs는 LCs보다 수가 많고 면역 반응에서 특징적인 역할을 수행한다. LCs와 dDCs를 구분하는 차이점은 CD11c의 발현이다. CD1c(혈액 DC 항원-1) 분자 역시 dDCs에서 발현되나 LCs에서는 발현되지 않는다. dDCs는 전형적으로 진피의 혈관주위에 분포한다.
생체 외 실험에서, dDC와 LC는 T 세포에 가용성 항원(soluble antigen)을 제시할 수 있는 기량은 비슷하다. 하지만 이 두 세포는 면역 반응에서 이들의 기능이 차이가 있음을 나타내는, 특징적인 TLR 발현 양상을 가지고 있다. dDCs는 TLRs 1 - 8까지 발현하지만 LCs는 TLR2, TLR4, TLR5, TLR8의 발현 기능이 없다. 결과적으로 LCs는 그람 음성균과 그람양성균에 대한 반응성이 떨어지며, 피부에 군집을 형성하는 공생균(commensal bacteria)에 대한 염증반응의 개시를 차단하는 것 같다.  LCs와 dDCs는 바이러스 항원에 동등하게 반응한다. LCs와 dDCs의 TLR 발현 양상은 TCI를 위한 백신 제조를 설계함에 있어 중요한 고려 사항이다.
   3.3  T 세포(T cells)
상당한 수의 T 임파구들이 표피에서는 제한적으로 존재하며, 진피에서는 혈관 주위에 더 만연하여 존재한다. 비염증성 피부의 T 세포는 E-selectin에 대한 리간드(ligand)인 피부림프구 관련 항원(cutaneous-lymphocytep-associated antigen, 이하 CLA)을 발현한다.  피부 내피세포의 E-selectin과 CLA 양성 T 세포의 상호작용은 림프구의 피부로 선택적 이동을 촉진한다. 다양한 부착분자(adhesion molecule)와 백혈구 화학 유인 물질(chemoattractants), 세포 표면 표지자(cell surface marker)는 또한 T 세포의 피부로 귀소(homing)와 연관되어 있음이 보여 주었다. 이러한 맥락에서 흥미로운 사실은, 태양 빛에 노출되어 피부에서 생성된 비타민 D3가 DC의 아집단, 대식세포, 각질형성세포에 의해 활성화 형태(1,25,(OH)2D3)로 전환될 수 있다. 이러한 활성화 형태가 T 세포의 CCR10 케모카인 수용체 발현과 각질형성세포에서 만들어진 CCL27로의 이동을 유도하는 것으로 생체 외 실험에서 밝혀졌다. T세포의 피부로의 귀소를 통제하는 메커니즘과는 상관없이, 대규모의 T 세포 집단이 피부에 지속적으로 존재하며 이곳에서 항원을 포획한 DC와 즉시 반응한다는 것은 명확한 사실이다.
피부에 상주하는 T 세포는 표현형적으로 다양하지만, 대부분은 Th1 기억세포(effector memory cell)이며 적은 수의 Th2 세포, 핵심기억세포(central memory cell), 조절 T 세포(regulatory T cell)이다. 표피의 T 세포는 기저 각질층에 있는 LCs 근처에서 발견된다. 표피의 T 림프구 대부분은 CD8+ αβ이다. 반대로 CD4+기억 T 세포는 진피 맥관 주위에 지배적이다. 진피의 T 세포는 외피 -진피 결합 부위내의 모세관후세정맥 (postcapillaryvenule) 주위에 집중되어 있다. CD4+ Th1와 Th2, Th17의 일부 아집단은 진피에서 발견된다. 이것들은 염증성 피부 질환과 연관되어 있지만, 피부에서 APCs에 충돌한 항원에 대한 면역 감시와 면역 반응에도 관여하는 것 같다.
   3.4  다른 면역 반응 세포(other immune-responsive cells)
피부의 다른 세포군들도 TCI의 결과에 기여한다. 「Heib et al. 2007」는 LC이동, 염증, TCI에 따른 CTL 반응의 유도에서 진피의 비만세포가 하는 역할에 대해 보고하였다. 대식세포 집단은 단핵구(monocyte)와 대식세포에 선택적으로 발현되는 청소제 수용체(scavenger receptor)인 CD163을 바탕으로 정상인의 사람 피부의 표피에서 동정되었다. 이러한 세포들은 T cell의 증식을 미약한 자극제인 것으로 보인다. 피부 면역 반응에서 대식세포, 과립구(granulocyte), 자연살상세포(NK cells), 및 γδ T 세포들의 역할은 아직 명료하게 밝혀지지 않았으나, 이러한 지식은 이 세포들이 우리가 의도한 면역 반응을 발생시킬 수 있도록 피부를 통한 백신을 설계하고 제조하는 데 도움이 될 것이다.

4.  피부로부터 항원의 이동(Antigen migration from the skin)
피부 표면과 평행하게 달리는 림프관들의 망상 조직들은 표피층 바로 아래에 위치한다. 이 관들은 상호 연결된 그물과 같은 망을 형성하고, 약간 더 큰 관을 통해 진피층 더 깊은 부분의 집합 림프관(collecting vessels)으로 빠져나간다. 집합 림프관은 활발하게 림프액을 조직으로부터 림프절로 나아가게 한다. 이러한 림프관에서의 흐름은 단일방향이므로 림프절에서 세포들과 분자들의 흐름을 되돌리거나 말초에서 세포에 직접적으로 영향을 주지 못한다.
피부를 통해 주입되는 물질들의 이동은 이러한 면역 경로를 통해 유도되는 반응들의 이해를 돕기하기 위해 형광 염료, 형광 표식 단백질, 전자 현미경 등을 이용하여 연구한다. 단백질 면역원과 함께 혹은 단백질 면역원 없이 피부에 가해진 형광 염료는 쥐의 말단 림프절이 아닌 국부의 유출 림프절에서 접종 24시간 이후에 발견되었다. 단백질 면역원이 있을 경우, 피부를 통한 접종된 부위로부터 가장 가까운 림프절에 DC 활성화 표식자의 증가가 인지되었다. 초기 연구에서 이러한 단백질의 피부 처치 후 4시간만큼 빠르게 유출 림프절에서 ferritin을 함유한 LCs가 관찰 되었다.
langerin 유전자의 통제 하에 녹색형광 단백질(GFP)을 발현하는 knock-in 쥐의 이용으로 dDC의 이동경로와 LC를 비롯한 다른 langerin+ 세포들의 이동경로를 구별할 수 있게 되었다. dDC는 처치 24시간후에 림프절에 도달한 반면에 GFP가 표지된 LCs들은 24시간 이후 까지도 검출되지 않았다. 비슷한 기술을 이용하여 LCs와 다른 APCs들의 상대적인 이동은 쥐에서 TCI한 부위(예를 들면, 귀 혹은 옆구리)에 따라서 달라질 수 있음을 보여 주었다. 전체적으로, 이러한 연구들을 통해 LC를 비롯한 다른 세포군 들이 TCI 이후 항원의 유출 림프절까지 이동에서 활발한 역할을 하고 있음이 입증되었다.
형광 표식 대장균 이열성독소(열에 민감한 독소, LT)가 쥐의 피부에 가해졌을 때 형광 표식은 장관 Peyer’s patch의 APCs에서 발견되었으나 24시간과 48시간 후에 비장이나 비유출(non-draining) 림프절에서는 검출되지 않았으며, 이는 APCs가 피부로부터 장 임파구로 항원을 직접 제공하기 위해 이동함을 시사해 준다.  이러한 피부 유래 APCs들이 다른 위치의 점막에 도달하는지는 아직 밝혀지지 않았다.

5.  피부를 통한 백신의 보강제 (Adjuvants for transcutaneous Vaccines)
TCI를 통한 항원 특이 반응을 촉진하는 중요한 요소는 피부의 APCs를 활성화시키는 방법의 선택이다. 다양한 전략들이 면역 반응의 강화에 이용되었다. 각질층의 파괴(tape stripping, microneedles, 전기충격(electrical impulses)), 장기적 수화(prolonged hydration), micro- 또는 nano운반체의 이용, 그리고 imiquimod, CpG, 및 박테리아의 장독소 등과 같은 보강제의 사용 등이 이에 해당한다.
BARE(bacterial ADP-ribosylating enterotoxin) – 다양한 Vibrio cholerae 균주에 의해 생성되는 CT와 이와 밀접한 연관이 있는 장관 독소 생성 Escherichia coli에 의해 생성되는 LT - 는 전신성, 점막성, 그리고 피부를 통한 백신에서 효과적인 보강제이다. CT와 LT는 모두 A와 B 성분을 갖는 multisubunit 독소로 합성된다. A-서브유니트는 효소적 활성 성분이고 이황화물 고리(disulfide loop)를 경계로하는 단백질 가수분해에 민감한 결합(Arg192)으로 합쳐진 2개의 고리 A1과 A2로 구성되어 있다. 다른 A-B 독소들처럼 CT와 LT역시 완전한 생물학적 활성을 갖기 위해서는 nicking(연결에 틈이 생기는 것)과 이황화결합의 환원을 필요로 한다. CT나 LT가 처음 포유류의 세포와 만나게 되면 B-서브유니트 오량체(pentamer)의 상호작용을 통해 세포 표면에 결합한다. CT나 LT의 A2 펩타이드는 A1과 B-pentamer의 연계를 용이하게 하며, Golgi 구조를 통하여 이러한 분자들의 ER로의 직접 역행 운반을 돕는다. ER에 도달하게 되면 A1 사슬은 막을 통해 세포질로 이동하여 NAD+와 결합하여 NAD+의 ADP-ribose 부위를 이형삼합체(heterotrimer) GTP-결합 단백질 계통(family)의 일원인 α 서브유니트로 이동시킨다. 그 결과로 adenylate cyclase가 비가역적으로 활성화되어 세포 내의 cAMP 농도가 증가되는 결과를 초래한다. 상승한 cAMP 수준은 CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; 낭포성섬유증막전위조절자) 염소 이온 채널(chloride channel)을 인산화 시키고 개방하는 단백질 인산화효소 (protein kinase A)를 활성화 시킨다. 염소 이온의 유출은 부수적인 장관 내로 수분의 삼투적 이동의 결과를 가져와 인간에서 콜레라나 장관독생산성 대장균에 감염의 특징적인 다량의 장액성 설사가 수반되게 되는 결과를 가져오게 된다.
CT는 DC에 공동 촉진(co-stimulatory) 분자들의 발현을 상향 조절하고, DC의 운동성, 성숙과 활성화를 촉진한다고 보고되었다. 그러나 DC에 대한 BARE의 보강제 효과에 대한 정확한 메커니즘은 아직 알려지지 않았다. BARE는 Th1/Th2 혼합 면역 반응이나 Th2 편향 면역반응을 이끌어낼 수 있는데 이는 세포에 유도된 cAMP의 농도에 의존적일 수도 있다. 왜냐하면 cAMP가 인터페론 조절 인자 8(interferon regulatory factor 8)의 전사인자 활성화를 억제시킴으로써 DC의 IL-12 생성을 궁극적으로 억제하기 때문이다. 소수의 연구만이 CT와 LT가 피부유래 APC에 가하는 영향을 다루고 있다. 한 연구는 피부 면역 후 CT 보강제 활성이 활성화된 표피층의 LCs와 각질 형성 세포(keratinocyte)로부터 전염증성 사이토카인의 분비에 기인될 수 있음을 제시하였다. 또한 각질 형성 세포의 세포소멸(apoptosis)은 세포간 공간을 형성하게하고 결과적으로 보강제와 항원 분자의 확산을 더욱 더 원활하게 해준다는 제시되었다.
메틸화되지 않은 CpG ODNs(CpG oligodeoxynucleotides)는 TLR9의 작용물질(agonist)이다. CpG ODN의 보강제 활성은 선천성 면역과 적응 면역의 여러 다른 효과의 결과로 본다. 첫째로, CpG ODN은 B 세포를 통하여 중재되는 항원 특이 영향과 강하게 협력하여 B 세포들이 증식하고 면역 단백질(immunoglobulin)을 분비하게 하는 요인이 된다. 더불어, CpG ODN은 항원 제시를 개선시키는, 공동 촉진(co-stimulatory) 분자와 MHC class 2 분자의 발현을 상향 조절한다. CpG ODN은 또한 단핵 백혈구(monocyte), 대식세포(macrophage), DC를 직접 활성화시켜 IFN-α/β, IL-6, IL-12, GM-CSF, chemokines, TNF-α를 분비하게 하고, 결과적으로 T cell을 자극하여 추가적인 사이토카인(cytokines)를 분비하게 하고 자연 살상 세포(natural killer cell, NK cell)가 IFN-γ를 분비하게 촉진한다.  T-helper의 기능은 Th2 사이토카인의 분비가 거의 없고, IL-12와 IFN-γ가 주를 이루는 강력한 Th1 유사 사이토카인 생산으로 제공된다. CpG ODN의 면역 활성 효과를 일으키는 정확한 메커니즘은 현재에 와서야 풀리고 있다. 하나의 가설은 CpG-DNA(유리된 분자 또는 세균에 둘러싸인  상태)가 APC에 포획되는 것이다. 클로르퀸 민감성(Chloroquine-sensitive) 경로를 통해 처리된 후에, TLR9의 연계로 신호전달이 시작된다. 골수성 분화 인자 88(MyD88; protein myeloid differentiation factor 88), 인터루킨-1 수용체-연관 키나제(interleukin-1 receptor associated kinase), 종양 괴사 수용체 연관 인자6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)와 같은 단백질들이 IkB kinase와 미토겐 활성 단백질 키나제(mitogen-activated protein kinase)같은 세포 인산화 효소들을 활성화시킨다. 이들의 잘 알려진 경로를 통한 신호 전달은 유전자 유도를 초래하고 사이토카인(cytokine) 분비와 같은 작동자 기능을 일으킨다. CpG ODN은 피부를 통해 전달되는 백신의 효과적인 보강제로서의 작용함을 보여 주었다.
이미퀴모드(Imiquimod;1-(2-methylpropyl)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amine)는 TLR7의 리간드인 imidazoquinoline의 합성 유도체이다. 이미퀴모드(상품명은 Aldara™)는 FDA가 승인한 인간 외부 생식기 사마귀, 광선각화증(actinic keratosis), 기저세포암(basal cell carcinoma)의 치료약이다. 이 물질은 면역 조절자 역할을 하며 체외(in vitro)에서 MyD88 의존적 DC 성숙과 염증 시토카인의 분비를 유도함으로써 DCs를 활성화시킨다. 「Rechtsteiner et al. 2005」는 최근 연구를 통해 CTL 항원결정인자(epitope)를 imiquimod와 함께 피부에 적용이 T cell 증식, 세포용해작용, IFN-γ 생성 을 특성으로하는 목표물에 대한 강경한 CTL 반응이 유도 된다고 보고 하였다. 쥐의 피부에 imiquimod의 국소적 도포는 표피에서 국소 림프절로의 LCs의 이동을 유도하였다.  또한 imiquiomod는 인간 표피층에 있는 LCs의 성숙을 유도하고, IL-12의 생성을 촉진하며, CD4+ T 세포에 의한 IFN-α생성을 증가시킨다는 사실을 입증하였다.  표피층의 LC에 대한 이미퀴모드(imiquimod)의 효과는 이미퀴모드가 특정 악성종양 치료 중 그 자리에서 Th1 지배적 세포 반응을 유도함에 의한 중요한 작용 기전에 관여되는 것으로 판단된다.  비록 dDC, LC와 각질형성세포가 세포질 내 TLR7을 발현하는 것은 알려져 있지만, 피부에서 유래한 APC의 활성화에 imiquimod가 정확히 어떤 효과를 나타내는지는 아직 정의되지 못하였다.
다양한 나노운반체와 특별 맞춤 제조법들은 각질층을 통한 투과성을 증가시키거나 또는 APC와 다른 세포들에 의한 항원 흡수를 증가시킴에 의해 TCI에 대한 가능성을 보여 준다. 쥐에서, Helicobacter pylori백신의 피부를 통한 처치를 위하여 지질 기질(lipid matrix)의 사용은 비록 CT와 CpG를 지질 제조에 추가하면 방어력이 향상되었다 할지라도 동시 처치 보강제가 없이도 균으로부터의 위 방어 작용을 유도하였다. 피막화되거나 흡수된 항원을 포함하는 미립자의 마이크로, 나노운반체의 사용은 피부에서 항원 흡수에 영향을 미칠 수 있다. 입자의 구성 성분(지질, 중합체, 바이러스 유사 입자 등), 크기, 전하, 분해가능성 등이 면역 반응에 관여하는 DC와 T 세포, B 세포, 기타 구성요소들과 상호작용을 위한 중요한 요소이다. 「Mishra et al. 2006」은 생체외 대식세포의 흡수와 생체내 림프관 축적, 소포 확장, 피부를 통해 도입된 탄력 지방소체와 혈청 및 타액의 IgA와 반응 등이 증가됨을 기술하였다. 이는 TCI에 대한 면역 반응을 유도하는 데 있어 이러한 운반체들의 역할을 뒷받침 해준다.
정리하면, 보강제가 백신의 피부를 통한 처치에 대해 피부의 DC를 활성화시키는데 근본적인 역할을 함이 명백하다. 서로 다른 보강제들이 피부의 APC가 궁극적으로 T 세포 활성화에 어떻게 영향을 미치는지를 이해하기 위해 연구를 설계하는 것이 중요하다. 피부에 있는 APC의 성숙과 활성화에 대한 보강제의 효과를 판별하는 것은 특정 병원물질과 특정 면역 반응에의 맞춤 백신 개발을 가져오게 될 수 있다.

6.  쥣과 모델에서 피부를 통한 항원에 대한 점막 면역 반응(mucosal immune responses to transcutaneous antigens in murine models)
직접적인 국소 적용에 의해 이루어지는 TCI는 효과가 있을 것으로 생각된다. 그 이유는 백신의 구성성분이 피부를 통과하여 표피와 진피에 있는 APC와 직접적으로 반응하고, 이러한 APC들이 이동하여 적응 면역 반응을 개시할 수 있도록 임프절에서 원시(naïve) T 세포와 상호 작용하기   때문이다. 여러 발표 논문들과 임상 실험 결과들은 TCI는 동물과 인간에서 확고한 전신성과 점막 면역 반응을 유도할 수 있음을 보여주고 있다.
   6.1  생쥐에서 TCI 후에 나타나는 점막 항체 반응(mucosal antibody responses in mice following TCI)
TCI 후 점막 조직에서 항원 특이적 항체 반응의 유도는 여러 동물 모델, 특히 쥐 모델에서 충분히 입증되었다. 특이 면역 항원에 대한 IgG와 IgA 항체들은 위장관, 호흡관, 및 비뇨생식관에서 관찰되었다. 이러한 반응의 조절과 연관된 메커니즘은 아직 확실하지 않지만, 최근의 연구에 따르면 활성화된 DC가 피부로부터 장 점막(mucosa)으로 이동함이 밝혀졌다. 「Chang at el. 2008」은 파상풍 독소(tetanus toxoid, TT)나 CT로 TCI를 한 후에는 소장과 대장에서 항원 특이적인 IgG와 IgA 항체 분비 세포(antibody-secreting cell, 이하 ASC)를 발견하였으나 피하 면역이나 복강 면역 후에는 발견하지 못하였다. 다른 이들도 또한 다양한 항원과 보강제 조합으로 TCI를 한 후 장관에서 특이적 항체가 유도됨을 보고하였다. 이러한 연구들 중에서, 몇몇 중요한 관찰에서는 대변의 항-OVA IgA와 IgG, 항-E. coli CS6 IgA와 IgG, 그리고 항-H. pylori IgA의 생성을 담고 있다.
치주염 관련 병원체들에 대한 방어를 위해 TCI의 적용이 연구되었다. 쥐에서 Porphyromonas gingivalis의 단백질 면역원과 CT 보강제로 TCI를 하였을 때 비장에서 항체 특이적인 IgA와 IgG ASC가 유도되었다. 하지만 침샘에서는 ASC가 훨씬 적은 수로 관찰되었다. 장기 연구에서, 면역 1년후 혈청의 IgG와 IgA, 타액의 IgG수치가 증가된 채로 유지되었으며 P. gingivalis로 인위적 공격은 뼈의 손실이 상당히 줄어드는 결과를 가져왔다.
TCI를 적용한 암컷 쥐들의 생식관에서 항원 특이적 ASC가 유도될 수 있음이 또한 밝혀졌다. 한 연구에서는 TT와 CT를 TCI 한 쥐들의 자궁과 질에서 발견된 ASC의 수가 작은창자와 침샘에 존재하는 ASC의 수보다 많은 것으로 관찰되었다. 이 쥐들의 대변, 질 분비물, 타액, 및 혈청에서도 IgG와 IgA 항체들이 발견되었다. CT 보강제가 없을 시에는 점막 또는 전신성 IgA 반응들이 없었다. Chlamydia muridarum의 주요 외막 단백질(major outer membrane protein(MOMP))로 TCI를 한 쥐의 질조직에서 항원 특이적 ASC의 수가 CT를 사용했을때와 비교하여 CpG ODN을 동시에 처치했을 때 확연히 증가하였다. 또 다른 연구에서는, MOMP와 CpG, CT의 혼합물로 TCI를 하였을때 폐조직에서 항원특이적 ASC가 유도되었으며 C. muridarum에 의한 인위적 공격에 대해 방어가 유도 되었다. 최근 「Hickey et al. 2009a」가 C. muridarum의 MOMP와 Lipid C(a lipid-based adjuvant), 또는 CpG를 추가한 CT로 TCI를 하면 MOMP 특이적 폐 IgG와 질의 IgG, IgA가 유도될 수 있고, 질이나 비강을 통한 C. muridarum의 감염에 대해 부분적으로 방어될 수 있음을 보고하였다.
    6.2  쥐에서 TCI 후 나타나는 세포성 면역 반응(cell-mediated immune responses in mice following TCI)
TCI에 대한 반응으로 점막 항체들의 유도는 광범위하게 연구된 반면, 이러한 면역 전략에 의해유도되는 항원 특이적 세포성 점막 면역 반응(antigen-specific cellular mucosal response)은 아직 깊게 연구되지 못했다. CD8+ T 세포의 증식은 쥐를 사용한 생체 실험에서 관찰된 하나의 세포성 반응이다. 피부에서 유래한 DC는 재조합 바이러스 벡터로 TCI 후 항원 제시와 CD8+ T 세포반응을 유도하는 데 직접 관여 함을 보여 주었다. Imiquimod에 T 세포의 항원결정인자 (epitope)를 포함한 펩티드를 첨가하여 TCI를 하면 비장에서 항원 특이적인 CTL이 생성된다.
쥐 점막의 세포 매개 반응은 HIV 펩티드로 TCI를 한 후에도 인지되었다. 경피를 통해 백신을 처치한 후 항원 특이적 CD8+ CTL들이 소장의 Peyer’s patch와 비장에서 관찰되었다. CT나 LT, 또는 CT와 CpG의 혼합물이 백신의 보강제로 사용되었다. 이러한 면역 전략은 HIV의 gp160을 부호화한(encoding) 재조합 백신 바이러스로 쥐의 직장에 인위적 감염 후 바이러스 수가 감소되는 결과를 보였다.
C. muridarum  MOMP와 CT, CpG의 혼합물로 TCI를 한 쥐에서, 균형적인 Th1/Th2 사이토카인 반응이 관찰되었고 C. muridarum의 인위적 감염 후 제거 정도도 질내 접종 이후에 향상되었다.
 TCI에 사용되는 대부분의 항원은, 비장이나 피부의 유출림프절에서 일어나는 항원에 대한 림프구 증식이나 사이토카인 반응을 유도하기 위해 보강제의 사용이 필수적이다. 흥미롭게도, TT에 대한 보강제로 CT를 사용하여 TCI를하면 Th1/Th2 반응이 혼합되어 나타났는데, 이는 CT와 TT를 사용한 구강 또는 비강면역이 Th2 반응을 우세하게 일으키는 것과는 대조적이다. LT 보강제와 이 단백질의 변이체 (LT-R192G)를 피부를 통해 적용함은 또한 임프절에서 확고한 항체 생산, 임파구 증식 그리고 사이토카인을 생산하는 균형적인 Th1/Th2 반응이 유도되었다.
피부를 통한 백신의 효력을 증가시키기 위한 흥미로운 접근 방법은 정제된 소단위 항체(purified subunit antigens) 대신 미생물체 전체로 면역시키는 것이다. CT의 사용여부와는 무관하게 포르말린으로 비활성화시킨 인플루엔자 바이러스의 TCI는 사이토카인 뿐 아니라 전신 및 점막 항체 반응이 유도되었다. CT가 백신 제제에 함유된 경우에는 혈구 응집 억제와 중화 항체의 역가가 증가되었다. 이실험은 또한 비활성화된 인플루엔자 바이러스를 통한 TCI가 CD4+와 CD8+ T 세포에 의한 IL-4, IFN-γ의 분비를 유도하며, CT 또는 다른 두 가지의 면역강화제-올레산(oleic acid), 레티노산(retinoic acid)-존재시 이러한 반응이 훨씬 강력해지는 것으로 드러났다.
이러한 연구들을 통해 TCI에 대한 세 가지 중요한 개념을 알 수 있다: (1) 쥐 모델은 피부를 통한 항원/보강제 병용은 면역 발생 정도를 측정하는 데 유용하다. (2) 항원 특이적 항체와 T 세포는 TCI를 사용하여 구강, 소장과 대장, 호흡기, 암컷 생식기의 점막 조직에서 생성될 수 있다. (3) 다른 경로를 통한 면역들과 마찬가지로, TCI에 의해 발생하는 면역 반응의 정도와 질은 보강제에의해 많은 영향을 받는다.

7.  사람에서 TCI후 점막 면역 반응(Mucosal immune responses after TCI in humans)
사람에서 새로운 면역방법 (TCI)을 평가하기 위해 승인을 얻는 것은 어려운 과정이며, 개개인의 연구에서 테스트 할 수 있는 방법의 수를 제한하는 도덕적, 안전적 고려 사항들이 많다. 하지만 동물 연구로부터 예측된 TCI의 놀라운 이점과 안전성 측면은 여러 임상실험을 가능하도록 하였다. 사람에서 TCI의 안전성은 약독화바이러스와 세균독소를 사용한 연구에서 보여 주었다. 어떠한 심각한 부작용도 세개의 독립적인 TCI 연구에서 보고되지 않았다. 또한 백신을 처치 받은 사람들은 피하 경로보다 피부를 통한 경로로 백신을 접종하는 것이 더 적절하다고 평가하였다. 
「Etchart et al. 2007」는 약독화 홍역 바이러스를 사용하여 TCI를 수행하였다. 이 실험에서 유아들 처럼 성인들을 약독화 홍역 바이러스로 면역시켰다. TCI가 아닌 피하 경로가 실험전 이미 존재하였던 수준과 비교 했을 때 혈청 IgG 항체들은 증진되는 반면, 타액의 IgA는 피부를 통해 면역후 증가되었으나 피하 면역에서는 그렇지 못하였다. 또한 TCI는 말초 혈액의 단핵구 세포들에 의한 바이러스 특이적 IFN-γ의 생성을 유도하였으며, 이는 홍역 백신으로 TCI로 보강 접종한 후 Th1 반응이 나타났음을 의미한다.
항원인 동시에 보강제로 작용하는 E. coli LT를 사용한 TCI는 LT 특이적인 혈청 항체가 유도되며, 이것은 12주 후의 추가접종으로 증진되고, 35주에 이차 추가접 종으로 더욱 증가되었다.  소변과 대변의 IgG와 IgA 또한 발견되었다. 위약(placebo)과 비교 했을 때, TCI를 통해 적용된 LT 백신은 장독소 생성 대장균에 의한 여행자 설사의 발병과 중증도를 낮추는 데 효과적이었으며, 이는 TCI가 안전하고 장관 질병에 대한 방어력을 제공할 수 있음을 가리킨다.
또 다른 연구에서, 성인지원자에게 LT와 대장균의 집락 형성 인자 항원(colonization factor)인 CS6을 함유물을 피부 패치로 처치하였다. 백신을 받은 대다수의 지원자들은 지연 과민 반응이 나타났을 뿐아니라, 항-CS6 혈청IgG와 IgA 항체가 생성되었다. LT 보강제 없이 CS6만 제공받은 사람들은 가벼운 면역원성이 탐지되었다.
매년 사람들에게 대 규모로 투여될 수 있는 만큼 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 피부를 통한 백신은 아주 가치가 높다. 몇몇 연구는 인플루엔자에 대한 TCI의 적용 가능성을 보여주고 있다. 「Frech et al. 2005」는 전통적인 인플루엔자 백신을 주사한 부위 위에 LT를 함유한 패치를 붙인 후 인플루엔자 항원에 대한 혈청전환(seroconversion) 비율이 증가하는 것을 보여 주었다. 특히 이러한 효과는 나이가 많은 지원자들에게서 뚜렷하게 나타났다. 더 최근에 행해진 연구는 상용되어  이용가능한 인플루엔자 백신을 TCI로 접종한 후 인플루엔자 특이적인 IFN-γ를 생성하는 T 세포뿐 아니라 CD4 및 CD8 작동 T 세포 반응이 유도되었다고 보고하였다. 이 연구에서는 보강제가 사용되지 않았지만, superglue(cyanoacrylate glue, 시안화아크릴산 접착제)를 이용하여 피부에 테이프를 붙인 후 스트리핑(stripping, 떼어내기)하였다.
비록 사람에서 피부를 통해 처치되는 백신의 개발이 안전성과 효력이 주요 관심사이지만, 여기 제시된 많은 연구들은 전도 유망한 TCI 백신의 발달을 뒷받침하는 확고한 토대를 제공하고 있다.

8.  결론(conclusion)
피부는 침입한 병원체의 발견과 병원체에 대한 반응에서 핵심적인 방어적 역할을 수행한다. 피부표면을 통한 면역은 피부의 다양한 면역반응세포들을 통해 적응면역반응을 시작할 수 있도록 한다.  TCI와 중요한 항체와 세포성 반응에 관련되는 피부 세포들에 대해 세부적인 이해를 위해 우리는 지난 몇 십년의 긴 시간을 보냈다. 사람과 쥐의 모든 연구들은 방어적 전신 및 점막 면역반응을 유도하기 위한 TCI의 적용을 뒷받침 하고 있다. TCI의 사용에는 접종 부위, 필요할 시 해야하는 전처리의 유형, 접종량, 적절한 보강제의 선택등 고려해야 할 사항들이 많다. TCI에 의한 면역반응은 다양한 점막 부위(호흡기, 소화기, 여성의비뇨생식기)에서 발생하였으며, 이러한 비임칩적 면역 경로는 다양한 병원체들에 대한 방어를 위해 전도 유망한 백신 처치 전략을 수립할 수 있게 한다.

참고문헌